Teknik molekuler memungkinkan kita untuk mempelajari DNA secara langsung. Teknik molekuler yang dipilih untuk analisis DNA tergantung kepada tujuan dan tingkat variasi DNA dari organisme yang ingin dipelajari. Informasi molekuler yang telah diperoleh sebelumnya tentang organisme yang akan dipelajari sangat membantu untuk menentukan teknik molekuler yang tepat untuk menganalisis DNA organisme tersebut. Teknik molekuler yang biasanya digunakan untuk memperlajari molekuler ekologi adalah random amplified polymorphism DNA (RAPD), amplified fragment length polymorphism (AFLP), resctriction fragment length polymorphism (RFLP) dan perunutan DNA (DNA sequencing). Keempat teknik tersebut dikembangkan bedasarkan polymerase chain reaction (PCR-based). Karakterisitik keempat teknik molekuler tersebut di atas dapat dilihat pada Tabel 1.
RAPD merupakan teknik molekuler yang paling luas penggunaannya. Teknik ini sangat cocok untuk mempelajari organisme yang ketersediaan informasi genetiknya masih kurang. RAPD dapat mempelajari variasi genetik dalam populasi. Teknik ini dapat digunakan untuk mempelajari hubungan kekerabatan, menganalisis keturunan (paternity), menganalisis struktur populasi dan aliran gen, menentukan identitas biotype atau spesies, dan memonitor kemunculan dan pemencaran suatu biotype/spesies.
Dibandingkan dengan teknik molekuler lain, RAPD membutuhkan DNA dalam jumlah relatif sedikit, cepat, dan murah. Sedikitnya jumlah DNA yang dibutuhkan memungkinkan untuk melakukan reaksi ganda (multiple raction) DNA dari individu tunggal. RAPD menggunakan primer acak yang pendek (10-mers) sehingga tidak perlu mengetahui sekuen DNA untuk membuat primer. Namun hal ini menyebabkan masalah dalam pengulangan dan kehandalan teknik ini bila dilakukan dengan hati-hati. Kondisi RAPD harus dioptimasi untuk setiap spesies. Kadang-kadang diperlukan pengulangan PCR untuk menentukan konsistensi DNA yang teramplifikasi. RAPD-PCR sensitif terhadap konsentrasi DNA template, sehingga kondisi reaksi harus dioptimasi dengan hati-hati dan teknik ekstraksi DNA harus konsisten. Kualitas primer merupakan faktor yang kritis, sehingga harus menggunakan primer yang baru dan utuh (tidak terdegradasi).
AFLP digunakan untuk analisis perbedaan genetik antar individu, populasi dan spesies. Seperti halnya RAPD, teknik AFLP relatif murah dan handal untuk mengidentifikasi ratusan penanda genetik tanpa membutuhkan informasi sekuen DNA untuk mengembangkan primer. Kelemahan dari teknik adalah sulit utuk mengidentifikasi penanda yang homolog, sehingga teknik ini tidak dapat digunakan untuk identifikasi individu yang heterozygot. Dibandingkan dengan RAPD, teknik AFLP lebih mudah direplikasi tetapi lebih sulit digunakan dan dikembangkan.
Teknik molekuler lain yang sering digunakan untuk analisis ekologi adalah RFLP. Teknik ini dapat digunakan untuk analisis variasi genetik baik pada DNA mitokondria maupun DNA kromosom. Pola pita DNA yang dihasilkan dapat bervariasi tergantung pada jenis enzim restriksi yang digunakan dan sekuens DNA target yang akan dianalisis. RFLP membutuhkan DNA yang benar-benar bersih dalam jumlah yang relatif banyak. Teknik PCR-RFLP dilakukan dalam dua prosedur, sehingga lebih mahal dan memakan lebih banyak waktu.
Analisis keragaman DNA yang paling akurat adalah dengan perunutan nukleotida (sequencing) pada target DNA. Namun teknik ini relatif mahal dan memakan waktu. Sequencing membutuhkan informasi tentang urutan DNA target untuk mengembangkan primer yang sesuai. Karena mahal, teknik ini jarang digunakan untuk mempelajari populasi dalan skala besar tetapi lebih digunakan untuk mengembangkan primer spesifik alel untuk PCR.
Tabel 1. Teknik molekuler yang sering digunakan dalam molekuler ekologi
Teknik molekuler | Tingkat diskriminasi | Keunggulan dan keterbatasan |
RAPD - PCR | Perbedaan satu nukleotida dalam DNA kromosom | · Keunggulan : bermanfaat untuk spesies dengan informasi genetik yang terbatas, efisien, relatif murah, membutuhkan hanya sedikit DNA · Keterbatasan : sensitif terhadap konsentrasi DNA, hasilnya tidak memberikan informasi genetik, produk yang dihasilkan tidak spesifik hanya berdasarkan ukurannya sehingga dapat terjadi mis interprestasi |
AFLP - PCR | Dapat mendeteksi perbedaan dalam individu dan populasi | · Keunggulan : lebih handal daripada RAPD-PCR, lebih aman dibandingkan RFLP, tidak membutuhkan informasi sekuen DNA · Keterbatasan : membutuhkan DNA yang bersih dalam jumlah banyak, banyak tahapan (prosedur) |
RFLP - PCR | Dapat membedakan satu nukleotida dalam sekuen DNA yang dikenali oleh enzim restriksi | · Keunggulan : membutuhkan sedikit DNA dan relatif murah · Keterbatasan : membutuhkan primer spesifik, membutuhkan waktu lebih lama karena dilakukan dengan dua prosedur yang terpisah |
Sequencing - PCR | perbedaan pada satu nukleotida termasuk daerah gen (coding) maupun bukan gen (non-coding) | · Keunggulan : membutuhkan sedikit DNA, resolusinya tinggi, tersedia banyak primer universal · Keterbatasan : butuh waktu dan relatif mahal |
