Identifikasi Keragaman dan Klasifikasi Ralstonia solanacearum berdasarkan Teknik Molekuler

Ralstonia solanacearum adalah salah satu bakteri patogen tumbuhan yang paling merugikan. Patogen ini meyebabkan penyakit pada lebih dari 200 spesies dalam lebih dari 50 famili tanaman terutama Solanaceae. Serangan patogen ini secara nyata dapat menurunkan produksi dan kualitas hasil. Bakeri ini tersebar di daerah tropik, sub tropik maupun temperate/dingin. Di daerah tropis patogen ini berkembang dengan subur karena keberadaan inang sepanjang tahun. Di daerah temperate dimana tanaman inang tidak selalu ada, patogen ini menjadi penting (terutama pada kentang) lebih karena status karantinanya bukan karena kerusakan yang ditimbulkannya.

R. solanacearum merupakan kompleks spesies yang terdiri dari banyak genetik grup. Strain-strain R. solanacearum dibedakan terutama menurut ras atau biovar. Klasifikasi berdasarkan ras ditentukan berdasarkan kisaran inangnya, sedangkan klasifikasi berdasarkan biovar ditentukan berdasarkan kemampuannya untuk menggunakan jenis gula dan alkohol sebagai sumber karbohidrat/karbon. Tidak ada korelasi yang jelas antara ras dan biovar kecuali ras 3 yang biasanya merupakan biovar 2.

Tabel 1. Klasifikasi R. solanacearum berdasarkan ras dan biovar

Ras	Kisaran inang	Distribusi geografis	Biovar	RFLP 16S rRNA
1	Luas, beberapa genus tanaman	Asia, Australia Amerika	3 dan 4 1	I II
2	Pisang dan Musa spp	Karibia, Brazil, Filipina	1	II
3	Kentang	hampir seluruh dunia	2	II
4	Jahe	Asia	3 dan 4	I
5	Mulberry	China	5	I

Klasifikasi berdasarkan ras dan biovar merupakan klasifikasi berdasarkan pada kriteria fenotipik dan tidak mempertimbangkan genetik antar strain. Klasifikasi berdasarkan kriteria fenotipik membutuhkan pekerjaan yang banyak dan memakan waktu relatif lama. Kelemahan klasifikasi fenotipik ini dapat diatasi dengan klasifikasi secara molekuler yang dapat mengkarakterisasi suatu mikroorganisme dengan lebih cepat. Selain itu teknik molekuler dapat mengkaraktersisasi mikroorganisme yang tidak dapat dikulturkan (viable but unculturable).

Organisasi Genome R. solanacearum

R. solanacearum memiliki dua DNA sirkuler berukuran besar, yaitu kromosom dan megaplasmid. Kedua DNA ini memiliki gen penting untuk hidup bakteri, memiliki gen patogenisitas, dinukleotida yang sama relatif banyak, dan kemiripan dalam susunan dan distribusi sekuens sederhana berulang (simple sequence repeat). Persamaan ini menyebabkan dugaan bahwa kedua DNA ini telah berevolusi bersama (co-evolusi) sepanjang masa hidupnya. Namun mekanisme yang menyebabkan co-evolusi ini belum diketahui dengan jelas.

DNA kromosom disebut juga sebagai genom inti (core genome) atau gen penjaga (housekeeping genes) karena menyandikan protein yang esensial untuk kehidupan bakeri, ada pada semua spesies bakteri dan bersifat lestari (conserve) atau lambat mengalami evolusi. Keragaman R. solanacearum dapat dianalisis menggunakan DNA kromosom, tetapi tingkat diskriminasi yang tinggi dapat diperoleh melalui kombinasi analisis housekeeping genes dan gen dalam plasmid (flexible/accesory genome) yang lebih variabel dan terkait dengan virulensinya. Genom aksesori ini mengandung gen yang bervariasi antar strain, dapat dipertukarkan, dan biasanya meningkatkan daya hidup dari bakteri, misalnya gen yang terkait dengan virulensi, resistensi antibiotik, dan elemen yang dapat berpindah (mobile element).

Gambar 1. Dua genom pada R. solanacearum, yaitu kromosom (kiri) dan megaplasmid (kanan) dan posisi beberapa posisi lokus yang digunakan untuk analisis genetik

Ket. : ppsA, phosphoenolpyruvate synthase; gyrB, DNA gyrase (subunit B); adk, adenylate kinase (ATP-AMP transphosphorylase); gdhA, glutamate dehydrogenase [NAD(P)_] oxidoreductase; gapA, glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase oxidoreductase; hrpB, regulatory transcription regulator; fliC, flagellin protein; egl, endoglucanase precursor (endo-1,4-beta-glucanase)

Klasifikasi R. solanacearum berdasarkan Penanda Molekuler

Klasifikasi R. solanacearum secara genetik dilakukan berdasarkan beberapa teknik yaitu ALFP, RFLP, dan sequencing DNA. Target DNA yang digunakan dalam analisis adalah DNA kromosom maupun DNA megaplasmid. DNA kromoson yang sudah dianalisis adalah gen penyandi 16S rRNA, daerah internal transcribed spaces (ITS) dari gen penyandi 16S-23S rRNA, gen ppsA (phosphoenolpyruvate synthase), gen gyrB (DNA gyrase, subunit B), gen adk (adenylate kinase), gen gdhA (glutamate dehydrogenase oxidoreductase) dan gapA (glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase oxidoreductase), gen lpxC (UDP-3-O-acyl N-acetyl-glucosamine deacetylase), gen mutS, dan gen polygalacturonase. Sedangkan DNA megaplasmid yang dianalisis tediri dari tiga gen yang terkait dengan faktor vulensi, yaitu gen hrpB (araC = 1-β-D-arabinosa furanosylcystosine transcription regulatory protein), gen fliC (protein flagellin) dan gen egl (endoglucanase precursor).

Klasifikasi genetik berdasarkan gen penyandi 16S rRNA dengan teknik RFLP menunjukkan bahwa R. solanacearum terbagi ke dalam dua kelompok besar, yaitu Divisi I dan Divisi II (Cock, D. et al., 1989 dan Cock, D and L. Sequeira, 1994). Berbeda dengan klasifikasi berdasarkan ras dan biovar, klasifikasi berdasarkan gen penyandi 16S rRNA dengan teknik RFLP menunjukkan adanya korelasi antara divisi dengan biovar. Biovar 1 dan biovar 2 dengan sifat metabolisme yang kurang versatile masuk ke dalam Divisi II, sedangkan biovar 3,  4 dan 5 dengan metabolisme yang lebih versatile masuk ke dalam Divisi I (Tabel 1).

Klasifikasi berdasarkan genetik juga dilakukan oleh Fegan dan Prior (2003) berdasarkan analisis daerah ITS dari gen penyandi 16S-23S rRNA, gen hrpB dan gen egl menggunakan teknik AFLP atau RFLP. Klasifikasi ini membedakan R. solanacearum ke dalam empat phylotype yang mencerminkan distribusi geografis. Phylotype I terdiri atas strain rase 1 biovar 3 dari Asia. Phylotype II terutama berisi strain biovar 1 dari Amerika. Phylotype III merupakan strain dari Afrika dengan keragaman genetik yang paling besar, memiliki kisaran inang yang luas. Phylotype IV dengan keragaman genetik yang tinggi terdiri dari ras 1, 2 dan 3 serta biovar 1, 2 dan 2T. Phylotype ini terdiri atas strain dari Indonesia, Jepang dan Australia termasuk Pseudomonas syzygii dan Blood Disease Bacterium (BDB). Phylotype I dan II sama dengan Divisi I dan II berdasarkan klasifikasi oleh Cock et al. Lebih jauh lagi masing-masing phylotype  dibagi ke dalam grup yang lebih kecil yang disebut sequevar. Sequevar ditentukan berdasarkan sekuen parsial (sebagian) dari gen endoglucanase.

Villa et al. (2005) mengkaji keragaman R. solanacearum berdasarkan sekuen DNA berukuran 282 bp yang diamplifikasi menggunakan primer spesifik 759 (21 bp) dan 760 (24 bp). Identifikasi sekuen menunjukkan bahwa sekuen ini adalah gen lpxC (UDP-3-O-acyl N-acetyl-glucosamine deacetylase). Analisis keragaman genetik dilakukan berdasarkan perbandingan sekuen 237 nukleotida, yaitu sekuen teramplifikasi setelah dihilangkan primernya. Kajian ini menunjukkan bahwa R. solanacearum dikelompokkan ke dalam tiga grup. Lebih jauh lagi, ketiga grup ini dibagi kedalam 13 sub-grup berdasarkan multiple sequence aligment.

Grup I (4 subgrup) terutama terdiri atas strain ras 1 dari Australia, Jepang, Filipina dan Guyana. Grup II (4 subgrup) merupakan kelompok strain ras 1, 2 dan 3. Pembagian sub-grup pada Grup II menggambarkan klasifikasi berdasarkan ras dan biovar. Subgrup IIA (strain pisang) berkaitan dengan sequevar 3, 4 dan 6 sedangkan Subgrup IIB (strain kentang) berkaitan dengan sequevar 1 dan 2. Seluruh anggota subgrup IIB ini merupakan isolat biovar 2 ras 3. Grup III (5 subgrup) tersusun atas biovar 2 (Filipina), N2 (Jepang), BDB dan P. syzygii (Indonesia). Grup III sama dengan sub divisi 2b. Grup I, II dan III ini bersesuaian dengan phylotype I, II dan IV seperti yang diajukan oleh Fegan dan Prior (2003). Sayangnya kajian Villa et al. ini tidak menyertakan isolat dari Afrika yang masuk ke dalam phylotype III berdasarkan Fegan dan Prior.

Klasifikasi organisme berdasarkan sekuen DNA lebih akurat. Analisis sekuen gen lpxC dapat membedakan DBD dan P. syzygii yang merupakan kerabat dekat R. solanacearum. Meskipun akurat, klasifikasi berdasarkan sekuen DNA juga bersifat dimanis, dapat berubah tergantung pada DNA target yang disekuensing. Misalnya pada kasus R. solanacearum ini analisis berdasarkan sekuen gen polygalakturonase menunjukkan bahwa sub divisi 2b lebih dekat kekerabatannya dengan sub divisi 2a, tetapi berdasarkan sekuen gen endoglucanase dan daerah ITS 16S rRNA sub divisi 2b lebih dekat dengan divisi 1. Namun demikian, kedua hal tersebut menkonfirmasi adanya sub divisi 2b.

Pengklasifikasian berdasarkan AFLP-PCR sangat tergantung pada pemilihan primer yang tepat. Tingkat diskriminasi ditentukan oleh spesifisitas primer yang digunakan. Sementara itu, klasifikasi RFLP-PCR sangat bergantung pada enzim restriksi yang digunakan dan sekuen DNA target. Penggunaan beberapa enzim restriksi untuk klasifikasi R. solanacearum berdasarkan gen lpxC memberikan tingkat diskriminasi yang bervariasi. Analisis RFLP-PCR terhadap gen lpxC selain dapat membedakan DBD dan P. syzygii juga dapat membedakan R. solanacearum berdasarkan grup, subgrup, biovar maupun ras (Tabel 2).

Tabel 2.  Polymorfisme gen lpxC pada R. solanacearum, BDB dan P. syzygii yang dipotong dengan beberapa enzim restriksi

Enzim restriksi	Ukuran fragmen DNA (bp)	Grup/subgrup	Biovar/genus	Ras
NlaIII	116, 166 tidak terpotong 54, 228	I II III	3, 4, 5, N2 1, 2, N2 N2, P. syzygii, BDB	1 1, 2, 3 …
HgaI	55, 66, 161 27, 28, 66, 161 55, 227 24, 94, 161 121, 161	IA, IB, IC ID II IIIA, IIIB, IIIC, IIIE IIID	3, 4, 5, N2 3 1, 2, N2 N2, P. syzygii, BDB P. syzygii	1 1 2, 3 … …
DpnII, Sau3AI	46, 236	IIID	P. syzygii	…
NdeII, MboI, BsbrBI	51, 231	IIA	1	2
MspI, HphII	80, 87, 115 29, 51, 87, 115 80, 202 tidak terpotong	IIA IIB, IID IA, ID, III IB, IC	1 1, 2 3, 4, N2, BDB, P. syzygii 3, 4, 5	2 1, 3 1 1
McrI, MsiEI	35, 65, 183 202, 80 65, 217 tidak terpotong	I IIC IIA, IIB, IID, IIIA, IIIB, IIID IIID, IIIE	3, 4, 5, N2 1 1, 2, N2 P. syzygii	1 1 1, 2, 3 …
MnlI	48, 65, 68, 101 26, 65, 90, 101 101, 181 20, 45, 101, 116 65, 101, 116	IIID, IIIE IIA, IIB, IID IIC IA, IB, IC ID, IIIA, IIIB, IIIC	P. syzygii 1, 2, N2 1 3, 4, 5, N2 3, N2, BDB	… 1, 2, 3 1 1 …
Csp61	112, 170	IIC	1	1
RsaI	111, 171	IIC	1	1

Variasi genetik suatu organisme dapat disebabkan oleh adanya tekanan seleksi dari lingkungan. Untuk mempertahankan hidupnya, organisme harus dapat beradaptasi pada lingkungannya dengan melakukan perubahan-perubahan pada metabolismenya yang melibatkan perubahan pada tingkat gen. Jarak geografis dapat mempengaruhi variasi genetik dan struktur populasi apabila terjadi keterbatasan (penurunan) pertukaran genetik antar populasi tersebut sehingga menginduksi terbentuknya keragaman antar populasi.

Keragaman yang luas dari R. solanacearum tercermin dari kisaran inangnya yang luas, keganasan, dan daya adaptasi yang luas pada berbagai iklim yang sering dipengaruhi oleh genotipe inang, habitat alami, dan praktek budidaya. Phylotype II umunya dikenal sebagai ras 3/biovar 2 (R3B2) yang merupakan patogen penting pada kentang penyebab busuk coklat. Kelompok ini beradaptasi pada suhu lebih dingin dibandingkan kelompok lainnya, sehingga menjadi ancaman yang serius dalam pengembangan pertanian di daerah temperate.

Meskipun teknik AFLP-PCR, RFLP-PCR dan sequencing dapat menunjukkan keragaman R. solanacearum. Klasifikasi R. solanacearum berdasarkan penanda genetik menujukkan konsitensi dalam menentukan ras maupun biovar (Tabel 3). Namun untuk agar lebih akurat dalam klasifikasinya lebih baik mengkombinasikan beberapa teknik PCR (multiplex PCR). Teknik ini dapat digunakan untuk studi epidemiologi dimana distribusi suatu strain dapat ditentukan dengan benar. Selain itu, teknik molekuler berbasis PCR dapat mendeteksi keberadaan strain-strain yang sulit untuk dikulturkan secara in vitro dan dapat menunjukkan perbedaan antara strain secara konsisten.

Tabel 3.  Klasifikasi R. solanacearum berdasarkan penanda genetik dibandingkan dengan klasifikasi fenotipik

Distribusi geografis	ras	biovar	Grup berdasarkan penanda genetik
			16S rRNA	Phylotype	lpxC
Asia dan Australia Amerika Afrika	1	3 dan 4 1 1	I II	I II III	I II -
Karibia, Brazil, dan Filipina	2	1	II	II	IIA
Hampir seluruh dunia	3	2	II	II	IIB
Jepang, Filipina, dan Indonesia	4	3 dan 4	I	IV	III
China	5	5	I	I	I

Sumber bacaan :

1.     Castillo, JA and Greenberg, JT. 2007. Evolutionary dynamics of Ralstonia solanacearum. Applied and Environmental Microbiology 73 (4) : 1225–1238

2.     Villa, J., Tsuchiya, K., Horita, M., Natural, M., Opina, N., Hyakumachi, M. 2003. DNA analysis of Ralstonia solanacearum and related bacteria based on 282 bp PCR amplified fragment. Plant Disease 87 : 1337-1343.

3.     Schaad, NW., Jones, JB., and Chun, W. 2001. Laboratory Guide for Identification of Plant Patogenic Bacteria 3^rd edt. APS Press, St. Paul Minnesota.

4.     Hoy, MA. 2003. Insect Molecular Genetics : an Introduction to Priciples and Application 2^nd edt. Academic Press, Sandiago California USA. 544 pp.