Rabu, 15 Februari 2012

Teknik Identifikasi Bakteri

Identifikasi bakteri dapat dilakukan secara FENOTIPIK (morfologi, fisiologi, biokimia) dan GENOTIPIK. Identifikasi secara fenotipik hanya dapat dilakukan untuk bakteri yang dapat dikulturkan (culturable), sedangkan identifikasi genotipik dapat dilakukan untuk bakteri yang dapat maupun tidak dapat dikulturkan (unculturable).

Morfologi koloni bakteri meliputi bentuk, warna dan bau koloni dapat digunakan untuk identifikasi bakteri patogen tumbuhan. Pigmen yang dihasilkan merupakan hal penting dalam identifikasi awal bakteri. Namun beberapa bakteri patogen maupun non-patogen dapat memiliki koloni yang sama, sehingga identifikasi dengan morfologi koloni tidak akurat. Beberapa media semi selektif – diferensial telah tersedia untuk ddentifikasi bakteri berdasarkan morfologinya, misalnya TZCA untuk Ralstonia solanacearum (Gambar 1) dan King’s B untuk Pseudomonas kelompok fluoresence (Gambar 2).



Gambar  1.   Koloni bakteri Ralstonia solanacearum pada media TZCA : cembung, berlendir, berwarna putih dengan bagian tengah berwarna merah


Gambar  2.   Produksi pigmen fluorescent biru lemah (weak blue) oleh Pseudomonas syringae pv. phaseolicola (kiri) dan hijau kuning kuat (strong greenyellow) oleh P. syringae. pv. syringae (kanan) pada umur 3 hari pada media King’s B

Morfologi sel. Bakteri patogen tumbuhan umumnya gram negatif dengan bentuk batang. Namun adapula yang gram positif dengan bentuk filamen. Morfologi sel bakteri patogen tidak berbeda dengan bakteri non patogen sehingga dibutuhkan teknik lain untuk identifikasi bakteri patogen tumbuhan.

Karakteriasi fisiologi. Beberapa uji fisiologi yang dilakukan adalah kemampuan tumbuh pada kisaran suhu tertentu (40 atau 37°C), suhu lethal (thermal death point) untuk patogen tumbuhan biasanya adalah 50-55ÂșC pada medium cair selama 10 menit, toleansi terhadap NaCl, resistensi terhadap antibiotik, misalnya streptomycin untuk Erwinia amylovora uji produksi toksin, ice nucleation activity untuk Pseudomonas syringae group and Clavibacter spp.

Karakterisasi biokimia dapat menguji ekspresi genetik dari bakteri pada media uji, misalnya sumber C dan N, sifat oksidatif/fermentatif (OF),  LOPAT, dan produksi enzim tertentu. Beberapa kit komersial telah tersedia untuk pengujian biokimia ini, misalnya  API system strips dan BIOLOG system.



Gambar  3.   Uji OF untuk bakteri R. solanacearum (Rs) dan E. carotovora (E-1) : Warna kuning pada media tanpa parafin (b dan d) menunjukkan kedua bakteri bersifat oksidatif. Warna kuning pada media dengan parafin (c) menunjukkan bakteri bersifat fermentatif, sedangkan media akan tetap berwarna hijau (a) menunjukkan bakteri tidak bersifat fermentatif

Identifikasi secara genotipik tekniknya sama dengan deteksi dengan molekuler, yaitu menggunakan PCR seperti rep-PCR, BOX PCR, Nested PCR, RFLP, RAPD, AFLP, dsb. Masing-masing teknik PCR ini memiliki kespesifikan tersendiri. Untuk identifikasi yang lebih akurat dapat digunakan primer spesifik dan perunutan DNA (DNA sequencing). Semakin miripan sekuen DNA berarti semakin dekat hubungan kekerabatannya (tingkat keakuratan identifikasi).

Keunggulan identifikasi dengan teknik molekuler adalah :
·      Cepat, sensitif dan relatif lebih murah (cost effective)
·    Tersedia kit komersial dan terstandar
·    Dapat digunakan untuk bakteri yang tidak dapat dikulturkan maupun yang dapat dikulturkan
·    Dapat lebih mudah menelusuri GMO di lapangan
·    Tingkat diskriminatifnya tinggi, bisa sampai strain

Kelemahannya adalah :
·    Spesifisitas dan sensitivitas tidak dapat diketahui atau terbatas
·    Dapat terjadi hasil negatif karena gangguan faktor lingkungan atau biokimia
·    Tidak dapat membedakan sel yang mati dan yang hidup serta adanya cemaran asam nukleat di dalam sampel
·    Dapat terjadi kesalahan diagnosis (negatif atau positif palsu) yang sulit diverifikasi. Postulat Koch tidak terpenuhi.
·    Perubahan probe/primer/enzim/metode/bahan-bahan kimia yang digunakan dapat menyebabkan perbedaan hasil.
·    Hasilnya tergantung pada informasi sistem identifikasi yang sudah tersedia di bank data

Tidak ada komentar:

Poskan Komentar